Термін «біотехнологія» походить від грецьких слів “bios” життя, “techne” – майстерність,“logos”- вчення



Дата конвертації02.06.2016
Розмір445 b.



  • Термін «біотехнологія» походить від грецьких слів “bios” - життя , “techne” – майстерність,“logos”- вчення.

  • Біотехнологія - це сукупність технічних прийомів, що передбачають використання живих клітин або біологічних мікромолекул з метою вирішення конкретних або глобальних проблем біосфери та людства.

  • Біотехнологія рослинце сукупність технічних прийомів для модифікацій, поліпшення, створення та розмноження рослинних організмів, одержання з них корисних речовин. Фактично - це вирощування і маніпуляції з клітинами, тканинами і органами рослин поза організмом на штучних поживних середовищах у контрольованих умовах.



Основні переваги:

  • Основні переваги:

  • проводити швидке розмноження у дуже великих кількостях;

  • отримувати безвірусний матеріал;

  • поліпшувати існуючі та створювати нові сорти рослин;

  • вивчати складні процеси росту та розвитку рослин;

  • створювати принципово нові біологічні технології для сільського господарства, медицини, харчової та хімічної промисловості.



Основна мета досліджень біотехнології – це поліпшення існуючих та одержання нових сортів, видів, гібридів високопродуктивних форм рослин з поліпшеними показниками якості продукції і стійких до хвороб та шкідників (корисними ознаками для людини). Для цього у сучасній біотехнології виділено три основних напрями.

  • Основна мета досліджень біотехнології – це поліпшення існуючих та одержання нових сортів, видів, гібридів високопродуктивних форм рослин з поліпшеними показниками якості продукції і стійких до хвороб та шкідників (корисними ознаками для людини). Для цього у сучасній біотехнології виділено три основних напрями.



ОСНОВНІ ЕТАПИ РОЗВИТКУ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН:

  • ОСНОВНІ ЕТАПИ РОЗВИТКУ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН:

  • І ЕТАП



  • 1971-1975рр. – К.Као (Канада), Е.Кокінг (Великобританія), Е Такебе (Японія) розпочали роботи з ізолювання та злиття протопластів.

  • 1980-і роки – Ю. Глєба, В.Сидоров, М.Півень,

  • І Комарницький, Т.Пастернак (Україна) розпочали ряд робіт з ізольованими протопластами. Отримано соматичні гібриди та цибриди, розпочаті перші роботи з генетичної трансформації.

  • 1990-і роки – Е. Пірузян, В.Андріанова, В.Метт, І. Стехін (СРСР) – початок робіт з клонування генів і одержання перших трансгенних рослин.

  • 1994 р. – В США зареєстровано першу трансгенну рослину харчового використання – томат «Флейвр-Сейвр», що характеризується подовженим строком післязбирального зберігання.

  • 1999-2000 рр. – кількість трансгенних сортів рослин у світі досягає 120 і вони займають 40 млн. га посівних площ.

  • 2002-2005 рр. – посівні площі під трансгенними культурами в світі становлять більше 57 млн. га.





Тотипотентність (від лат. totus – весь, цілий, potencia

  • Тотипотентність (від лат. totus – весь, цілий, potencia

  • сила) – властивість клітин реалізувати власну генетичну

  • інформацію, яка забезпечує їх диференціацію і розвиток

  • до цілого організму. Тотипотентність клітин складає основу

  • наукової ідеології біотехнології рослин





За типом дії РРР поділяють на:

  • За типом дії РРР поділяють на:

  • стимулятори та інгібітори.

  • Проте такий поділ умовний, оскільки більшість із них в

  • низьких концентраціях стимулює, а у високих - пригнічує ті

  • чи інші процеси



Способи застосування синтетичних РРР:

  • Способи застосування синтетичних РРР:

  • намочування насіння, живців у їх розчинах;

  • обприскування вегетуючих органів рослин;

  • найефективнішим вважається обприскування

  • розчинами фіторегуляторів у поєднанні із

  • засобами хімічного захисту рослин від хвороб і

  • шкідників (так зване застосування бакових

  • сумішей).



Ауксини

  • Ауксини



  • Сучасне уявлення про фізіологічну дію ауксинів

  • Класична дія ауксинів - посилення росту за рахунок

  • стимуляції розтягнення клітин. ЮК активує роботу

  • мембранної помпи іонів Н+, знижує рН позаклітинного

  • середовища і посилює, тим самим, пластичність клітинних

  • стінок.

  • ІОК зумовлює явище апікального домінування, коли

  • апікальна меристема гальмує ріст бокових меристем.

  • Домінування верхівки — класичний приклад того, як одна

  • частина рослини контролює іншу за допомогою

  • фітогормонів



Природу апікального домінування пояснюють декілька гіпотез:

  • Природу апікального домінування пояснюють декілька гіпотез:



Цитокініни

  • Цитокініни



  • Фізіологічна дія цитокінінів

  • Цитокініни поліфункціональні у своїй дії на різних етапах

  • росту і розвитку рослин. Сучасна наробка фактичних даних

  • і їх обговорення дозволяють акцентувати увагу на двох

  • основних ефектах фізіологічної дії цитокінінів:

  • стимуляція процесів клітинного поділу і диференціації;

  • затримка процесів старіння відокремлених органів;

  • при взаємодії з ауксинами і гіберелінами цитокініни беруть участь у новоутворенні і диференціації органів ін вітро та ін віво, що пов'язують з їх впливом на біосинтез ДНК, РНК, білків, а також на перерозподіл продуктів обміну у рослині.

  • цитокініни стимулюють розвиток латеральних точок росту (бокових бруньок), тобто беруть участь у подоланні апікального домінування.



Гібереліни

  • Гібереліни



  • Фізіологічна дія гіберелінів

  • Різнопланові експерименти з вивчення фізіологічної дії

  • гіберелінів дозволяють зробити висновок, що гібереліни –

  • компоненти систем, які регулюють ріст і розвиток рослин

  • Найбільш виражена дія гіберелінів - їх здатність стимулювати ріст, видовження стебла за рахунок розтягування клітин ( а не їх поділу), що вказує на подібність із ефектом дії ауксинів. За допомогою гіберелінів відновлюють нормальний ріст карликових сортів гороху, кукурудзи або перетворюють карликову форму квасолі у витку ліану. На практиці гіберелінами обробляють коноплю та льон для підвищення виходу волокна.

  • Другий класичний ефект дії гіберелінів пов'язаний з виходом насіння злакових із стану спокою.



Важливе значення гіберелінів у процесі яровизації і цвітіння. Яровизація - реакція рослин на вплив низьких позитивних температур (+2 - +10° С) у певний період онтогенезу. Яровизація проявляється у прискоренні початку періоду плодоношення (цвітіння). Встановлено, що у ході яровизації підвищується рівень гіберелінів, що дозволяє холодову обробку замінити обробкою неяровизованих рослин гіберелінами.

  • Важливе значення гіберелінів у процесі яровизації і цвітіння. Яровизація - реакція рослин на вплив низьких позитивних температур (+2 - +10° С) у певний період онтогенезу. Яровизація проявляється у прискоренні початку періоду плодоношення (цвітіння). Встановлено, що у ході яровизації підвищується рівень гіберелінів, що дозволяє холодову обробку замінити обробкою неяровизованих рослин гіберелінами.

  • Гібереліни викликають партенокарпію - процес, при якому плоди розвиваються без запліднення. Для цього квітки рослин обприскують розчином гібереліну, що практич­но застосовується у виноградарстві (отримують без насіннєві ягоди великого розміру).

  • Здатність гіберелінів зміцнювати у деяких рослин вираженість статі. Встановлено, що вміст гіберелоподібних речовин в рослинах огірка корелює із кількістю чоловічих квіток. Багаточисельними робо­тами показана маскулінізація (зсування статі у чоловічий бік) рослин родини гарбузових гід впливом гіберелінів.



  • У 60-хроках в результаті незалежних досліджень А.Едікота

  • та П.Уорінга були відкриті специфічні речовини-інгібітори:



  • Фізіологічна дія етилену:

  • Класичний ефект дії етилену спостерігається у плодоовочевих сховищах або при тривалих морських транспортуваннях - перезрілі плоди посилюють дозрівання сусідніх, менш стиглих плодів.

  • Важливим ефектом фізіологічної дії етилену вважається також стимуляція опадання листків - етилен впливає на розростання прошарку відокремлення, який знаходиться біля основи черешка листка.

  • За допомогою низьких концентрацій кисню і високих концентрацій вуглекислого газу у середовищі проводять затримку дозрівання плодів при їх тривалому зберіганні. Кисень потрібен для утворення і дії етилену, а вуглекислий газ, навпаки, є його антагоністом.



Брасиностероїди

  • Брасиностероїди

  • У 1979 році було знайдено і виділено у чистому вигляді з

  • пилку ріпака Brassica napus L новий тип фіторегуляторів,

  • які описані в літературі під назвою брасиностероїди



  • Фізіологічна дія брасиностероїдів:

  • Після обробки брасиностероїдами виявлена сильнодіюча стимуляція росту зернобобових, овочевих. плодових культур. Японські вчені У.Такематцу, А.Такеучі (1989) при обробці пшениці у фазі цвітіння водним розчином одного з брасиностероїдів одер­жали збільшення маси колоса і кількості зерна у колосі на 20-30%.

  • Брасиностероїди сприяють збільшенню розмірів бульб картоплі.

  • Вивчається їх дія на тварин і людину (з хімічної точки зору вони споріднені з гормонами линьки комах - екдистероїдів).

  • Сучасні експериментальні дослідження свідчать про перспективність використання брасиностероїдів у сільському господарстві (у них невелика токсичність та дуже низькі норми витрат).



  • Основою мікроклонального розмноженняє регенераційна

  • здатність тотипотентних рослинних клітин.



Регенерацію рослин у культурі ін вітро можна здійснити

  • Регенерацію рослин у культурі ін вітро можна здійснити

  • такими шляхами:

  • Органогенез – утворення пагонів, коренів або рослин-регенерантів безпосередньо з експланту (апекса бруньки, листка, калусної тканини та ін.);

  • Культура зародків (важливий засіб збереження нежиттєздатних зародків шляхом пророщування їх в умовах ін вітро, на штучному поживному середовищі);

  • Соматичний ембріоїдогенез – утворення зарадкоподібних структур із соматичних клітин рослин.



умови вирощування – 80-90% вологість, 18-21ºС – температура, обприскування фунгіцидом (фундазол, каптан);

  • умови вирощування – 80-90% вологість, 18-21ºС – температура, обприскування фунгіцидом (фундазол, каптан);

  • через 5-6 тижнів біля зрізів великих жилок з’являються молоді рослини-регенеранти, які після короткого підрощування пересаджуються для адаптації.



Технологія мікроклонального розмноження росли

  • Технологія мікроклонального розмноження росли

  • складається з таких основних етапів:

  • Підбір експлантів і введення їх в культуру.

  • Активація розвитку пагонів з експланту при підвищеній концентрації цитокінінів живильного середовища.

  • Укорінення пагонів при збільшеній концентрації ауксинів в поживному середовищі.

  • Переведення одержаних рослин із стерильних умов у грунт, їх адаптація (перенесення з умов ін вітро в умови ін віво).

  • Термін «експлант» застосовують для назви вихідного

  • шматочка рослини, який вводять в культуру ін вітро.

  • В якості експлантів використовують верхівки пагонів,

  • бокові бруньки, частинки кореня або листка, черешок

  • листка, суцвіття, пелюстки квітів, гіпокотиль

  • проростаючого насіння та інші частини рослин.



Вибір експлантів:

  • Вибір експлантів:

  • Краще всього використовувати матеріал вилучений з здорових, сильних рослин

  • Верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева, мають більшу швидкість; розмноження, ніж верхівки з нижніх гілок;

  • Більшість експлантів добре вводяться в культуру у фазу активного росту донорської рослини;

  • Незрілі, молоді органи завжди більш пластичні з точки зору здатності до морфогенезу ін вітро, ніж старіючі, зрілі тканини та органи;

  • При виборі експлантів слід віддавати перевагу меристематичним тканинам, оскільки вони легше виживають у культурі, мають більшу швидкість росту і тотипотентність;

  • Розмір експланта теж визначає ступінь виживання ін вітро (крупніші за розміром верхівки пагона завжди краще виживають);

  • Важливими компонентами успіху є очистка і стерилізація рослинного матеріалу перед введенням його в культуру

  • ін вітро



  • ОСНОВНІ ЕТАПИ МІКРОКЛОНАЛЬНОГО РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН:

  • І ЄТАП

  • ВВЕДЕННЯ ЕКСПЛАНТА.

  • Відібраний і простерилізований експлант (найчастіше

  • меристематична тканина) вводиться в культуру на

  • спеціальне поживне середовище. Такі меристематичні

  • тканини знаходяться на кінчику основного пагона, в

  • пазухових бруньках, зародку – класичних експлантах для

  • мікроклонального розмноження рослин



ІІ ЕТАП

  • ІІ ЕТАП



ІІІ ЕТАП

  • ІІІ ЕТАП

  • УКОРІНЕННЯ ПАГОНІВ.

  • Після того, як утворилось багато пагонів, їх необхідно

  • укорінити і одержати повноцінні рослини. Основні

  • індуктори коренеутворення (ризогенезу) – ауксини. Для

  • формування коренів пагони відділяють і висаджують на

  • поживне середовище, яке містить ауксинів більше, ніж

  • цитокінінів. Це основне правило коренеутворення ін вітро,

  • яке має свої винятки. Під впливом ауксинів стимулюється

  • поділ клітин паренхіми пагона, що приводить до

  • диференціації кореневих зачатків в його базальній частині.

  • Стебло можна розрізати на 5-6 мікроживців, які у

  • сприятливих умовах виростають до нормальних рослин.

  • Процес дозволяє безперервно одержувати великі

  • кількості рослин.



ІV ЕТАП

  • ІV ЕТАП

  • ПЕРЕНЕСЕННЯ РОСЛИН В УМОВИ ІН ВІВО.

  • Основні вимоги:

  • вибір ґрунтового середовища у яке переноситься рослина,

  • здебільшого це суміш торфу з піском, перлітом або

  • вермикулітом;

  • перед висадкою у грунт корені рослин промивають у

  • розчині фунгіциду (фундазол, каптан, бенолат);

  • високий рівень вологості (90-100%) повітря, у якому буде знаходитись рослина після пробірки – найважливіший

  • фактор перших тижнів вирощування рослини загартовують – готують до відкритого ґрунту: поступово знімають покриття з рослини і зменшують вологість до природної;

  • при загартуванні рослин, як останній фазі адаптації,

  • необхідно приділяти увагу оптимальному живленню рослин



  • Для позначення рослин, одержаних безстатевим шляхом, у

  • 1903 році К. Вебером 6. був запропонований термін «клон»

  • (від грецького klon – гілка, пагін, паросток) – ряд

  • послідовних поколінь генетично однорідних організмів,

  • які утворюються в результаті вегетативного розмножен-

  • ня від одного загального предка.

  • Виділяють три основні категорії змін:

  • Генетичні, які пов'язані з плоїдністю, а також з хромосомними

  • і генними мутаціями.

  • Фенотипічні – пов'язані з морфологічними і анатомічними

  • характеристиками рослин.

  • Онтогенетичні – результат дезорганізації тканинних шарів

  • у химерних рослин, або спонтанного зміщення груп клітин у

  • вигляді ініціації росту адвентивних органів з різних шарів

  • тканини.



Клони, які одержані з меристем рослини-донора

  • Клони, які одержані з меристем рослини-донора

  • називають «мериклонами»

  • Аналіз сучасних досліджень дозволяє зробити висновок,

  • що для зниження частоти появи змінених форм у процесі

  • мікророзмноження рослин необхідно:

  • розмноження проводити на основі проліферації пазухових меристем;

  • у процесі культивування вилучати всі бруньки калусного походження;

  • вести розмноження по окремих мериклонах, щоб полегшити контроль за походженням рослин;

  • регулярно перевіряти агробіологічні характеристики вибіркових екземплярів мериклонів.



  • Переваги мікроклонального розмноження:

  • Високий коефіцієнт розмноження (до 1 млн. одиниць

  • садивного матеріалу за один рік, суниці, гербери, хризантеми

  • та ін. рослин).

  • Можливість розмноження протягом року незалежно

  • від погодних умов. Наявність лабораторії і теплиці дозволяє

  • це зробити.

  • Створення «банку» неінфікованого цінного селекцій-

  • ного матеріалу ( холодильник об’ємом 0,28 м3 вміщує до 2

  • тис. культуральних рослин, що у відкритому ґрунті така ж

  • кількість рослин займає від 5 до 6 га.

  • Можливість широкого обміну рослинним матеріалом

  • між регіонами і країнами. Зменшуються об’єми

  • перевезення матеріалу, легше вирішуються карантинні

  • питання.

  • Одержання безвірусного садивного матеріалу.



Віруси – неклітинні форми життя, які мають власний геном

  • Віруси – неклітинні форми життя, які мають власний геном

  • (молекулу ДНК або РНК) і здатні до відтворення лише в

  • живих клітинах хазяїна (рослини, тварини, бактерії), тобто

  • є паразитами на генетичному рівні.

  • Залежно від виду нуклеїнової кислоти розрізняють ДНК- і

  • РНК-вмісні віруси, які зверху оточені білковою оболонкою –

  • капсидом. Переважна більшість фітовірусів РНК-вмісні.



ГРУПИ

  • ГРУПИ



На практиці основними засобами боротьби з вірусними захворюваннями є:

  • На практиці основними засобами боротьби з вірусними захворюваннями є:

  • виведення стійких та імунних сортів с.г. культур

  • знищення комах, бур’янів, хворих рослин

  • регулювання строків посіву та збирання с.г. рослин

  • фізичні та хімічні засоби обробки насіннєвого та садивного матеріалу

  • вакцинація та ін.

  • метод культивування верхівочних меристем ін вітро у поєднанні з методами термо- і хіміотерапії

  • Перші дослідники:

  • У 1934 році один із засновників цього методу П.Уайт (США) повідомив, що віруси відсутні у кінцівках коренів рослин, уражених вірусом тютюнової мозаїки

  • Подібні результати були одержані у 1949 році в дослідах М.Корнюа і П.Лімансеякий

  • Ж.Морель і К.Мартен у 1952 році одержали безвірусні жоржини від уражених рослин.



Відсутність вірусів в апексах розміром 0,1 мм складає

  • Відсутність вірусів в апексах розміром 0,1 мм складає

  • основу методу одержання оздоровлених (безвірусних)

  • рослин з меристем in vitro

  • Чому віруси відсутні у верхівочних меристемах?

  • Існують такі спостереження:

  • Віруси повільно розповсюджуються по рослині;

  • Клітини меристем швидко діляться;

  • Серед клітин верхівочних меристем відсутні міжклітинники, недостатньо налагоджена система плазмодесм, що ускладнює апопластний і симпластний шлях переміщення вірусу;

  • Як правило, для ефективного звільнення від вірусів використовують шматочки меристем розміром

  • 0,10-0,15 мм.

  • Фактори, які мають стимулюючу або пригнічуючу дію на

  • віруси: температура, різні види випромінювання, постійне

  • магнітне поле, рН середовища, хімічні речовини.



  • Термотерапія рослин (дія високих температур) – один

  • із ефективних методів профілактики і лікування вірусних

  • захворювань. Піонером застосування термотерапії для

  • лікування рослин вважають П.Кобуса, який у 1889 році

  • використовував гарячу воду проти вірусного захворювання

  • цукрової тростини.

  • Новий етап у розвитку термотерапії почався у 1935 році,

  • коли американець Л.Кункель застосував гаряче повітря

  • для лікування персика від жовтухи, дрібноплодності і

  • розеточності.

  • Метод термотерапії передбачає інактивацію вірусної

  • інфекції – температурами 30-50ºC, які протягом певного

  • Періоду експозиції не завдають шкоди фізіології самої

  • рослини. Цей метод дозволяє брати для оздоровлення більші

  • За розміром меристеми, які набагато краще виживають на

  • поживних середовищах ін вітро (0,3-0,8 мм)



Отримання безвірусного садивного матеріалу картоплі

  • Отримання безвірусного садивного матеріалу картоплі

  • завдяки поєднанню методів верхівочних меристем і

  • термотерапії.

  • Ця технологія складається з таких етапів:

  • Термічна обробка матеріалу (бульб або укорінених верхівок)

  • Виділення верхівочних меристем і регенерація з них рослин

  • Індукція столоно- і бульбоутворення. Одержання мікробульб картоплі ін вітро.

  • Застосування цього методу дозволяє - за 3-4 місяці

  • одержати 2-3 тис. рослин придатних для висадки у грунт,

  • тобто близько 20 тис. мікробульб за 9-10 місяців з однієї

  • рослини. На експериментальній базі Інституту

  • Картоплярства одночасно розмножують 30 тис. рослин

  • ін вітро і одержують три врожаї на рік ( це становить

  • близько 100 тис. мікробульб). Розроблений метод скорочує

  • строки розмноження картоплі з 10 до 3-х років



  • Метод хіміотерапії базується на обробці рослин

  • речовинами – інгібіторами вірусів або на їх додаванні до

  • поживного середовища ін вітро.

  • Вчені вишукують антивірусні препарати, які виробляються

  • самими рослинами. Позитивні результати одержані в цьому

  • напрямку при використані екстрактів лаванди, ромашки,

  • шавлії та ін. лікарських рослин.

  • Іманін – антибіотик, вилучений із звіробою , сприяє підвищенню стійкості томатів до деяких вірусних захворювань.

  • Комплексне передсадивне застосування тіосечовини і гіберелінів для обробки бульб картоплі сприяє зниженню продукції Х і Y- вірусів у рослин.

  • Велике значення має рН середовище при самореплікації вірусу. У дослідах на картоплі встановлено, що при значеннях рН близько 10 відбувається дезагрегація вірусів і втрата їх активності



  • Метод верхівочних меристем і хіміотерапія успішно доповнюють один одного при використанні панкреатичної РНК-ази, яку додають до поживного середовища. Відсоток здорових рослин-регенерантів на середовищі з РНК-азою у 1,5-2 рази вищий, ніж без неї.

  • Щоб збільшити частку безвірусних меристемних рослин, до поживного середовища часто додають препарат «вірозол» (синтетичний рибоварин).

  • Метод мікрощеплення застосовують при умові, що насіння цитрусових, персика і багатьох плодових культур не передає віруси і залишається здоровим.

  • Рослини, які виросли у пробірці ін вітро з насіння, готують під бінокулярним мікроскопом для мікрощеплення –

  • рослину зрізують, а на кінці залишка стебла роблять

  • надріз, із яким щеплюють необхідний меристематичний

  • експлант.



  • Сучасний стан досліджень передбачає використання таки

  • методів діагностики на наявність у них вірусів:

  • Метод електронної мікроскопії (ідентифікація вірусів за допомогою електронного мікроскопу);

  • індикаторний (біологічний) метод (діагностики вірусів основана на використанні рослин-індикаторів)

  • Метод імунодіагностики (імуноферментний аналіз - виявлення комплексу антиген-антитіло).



Явище соматичного ембріоїдогенезу характеризується

  • Явище соматичного ембріоїдогенезу характеризується

  • утворенням зарадкоподібних структур (ембріоїдів)

  • нестатевим шляхом із соматичних клітин рослин.

  • Розрізняють прямий і непрямий шляхи соматичного

  • ембріоїдогенезу.



Прямий соматичний ембріоїдогенез – це процес

  • Прямий соматичний ембріоїдогенез – це процес

  • формування вегетативного зародка з тканин експланта без

  • проміжної стадії утворення калусної тканини

  • Непрямий соматичний ембріоїдогенез передбачає

  • утворення ембріоїдів з клітин калусної тканини і

  • складається з таких етапів:

  • 1. введення експланта в культуру ін вітро;

  • 2. стимуляція росту калуса і формування презародків;

  • 3. індукція формування біполярних зародків з презародків.



Загальні принципи калусоутворення:

  • Загальні принципи калусоутворення:

  • Калусні клітини – це дедиференційовані клітини, в які перетворюються спеціалізовані і меристематичні клітини при їх культивуванні на специфічних поживних середовищах in vitro;

  • Калусна тканина має вигляд аморфної маси тонкостінних паренхимних клітин без визначеної анатомічної структури. Клітини калусу мають велике ядро, високий вміст ДНК і РНК; деякі клітини здатні накопичувати крохмаль і речовини вторинного метаболізму;

  • Калусні клітини можна невизначено довго вирощувати ін вітро. Для цього необхідні періодичні пересадки (пасажі) невеликої частини утворених клітин на свіже поживне середовище через кожні 3-4 тижні;

  • Для індукції калусоутворення стерильні експланти (листки, черешки, сегменти стебел, корінців тощо) нарізують і поміщують на поживне середовище з високим значенням співвідношення ауксин/цитокінін: ауксину в середовищі повинно бути у 5-10 разів більше, ніж цитокініну;



При оптимально підібраному середовищі сегменти

  • При оптимально підібраному середовищі сегменти

  • утворюють калус через 3-8 тижнів.

  • Після перенесення невеличких частин калусних тканин

  • на середовище з рівним співвідношенням ауксин/цитокінін,

  • а потім - на середовище без фітогормонів формуються

  • емброїдоподібні структури рослини-регенерант.



  • Рослини-регенеранти, які одержані шляхом соматичного

  • ембріоїдогенезу, називають сомаклонами (синонім

  • сомаклональними варіантами). У 1981 році Р.Чалеф

  • запропонував символ R для рослин-регенерантів,

  • одержаних з культур клітин або тканин. Самозапилені

  • нащадки рослини R0 позначаються R1; наступні покоління

  • від самозапилення – R2, R3 і т.д.

  • Поява сомаклонів, що мають генетичні відмінності від

  • материнської рослини, обумовленна існуванням

  • сомаклональної мінливості. Це явище було відкрите на

  • початку 80-х років і вважається одним із перспективних

  • напрямків індукції мінливості в культурі ін вітро.

  • Невизначеність генотипів ембріоїдів, з яких утворюються

  • сомаклональні варіанти, обумовлює їх потенційну цінність

  • для поліпшення існуючих сортів рослин.



Природа виникнення сомаклональної мінливості пояснюється

  • Природа виникнення сомаклональної мінливості пояснюється

  • двома основними причинами:

  • генетична гетерогенність соматичних клітин експланта

  • вихідної рослини. Перша причина пов’язана генетичним

  • різноманіттям соматичних клітин у природі (різний рівень

  • плоїдності, химеризм). В клітинах меристемних тканин рослин

  • на різних етапах онтогенезу може відбуватися ендореплікація

  • хромосом і формування тканин з різним рівним плоїдності;

  • генетична і епігенетична мінливість, що індукується

  • умовами культивування.

  • Існує класифікація типів химерних тканин рослин:

  • Мозаїчні (гіперхемерні) – генетично різні тканини

  • утворюють мозаїчну структуру.

  • Секторіальні – різнорідні тканини розташовані окремими

  • великими ділянками.

  • Периклинальні – тканини, розташовані одна над одною.

  • Мериклинальні – суміш сектроріальних і

  • периклинальних ділянок тканин.



Методи ідентифікації сомаклонів:

  • Методи ідентифікації сомаклонів:

  • Морфологічний;

  • Цитогенетичний;

  • Метод білкових маркерів

  • Вивчення фрагментів ДНК):

  • Морфологічний метод базується на ідентифікації

  • сомаклонів за зовнішніми (морфологічними) ознаками: висота

  • рослини, розмір, форма і колір листків, квітів, плодів, насіння,

  • фертильність, урожайність, стійкість до хвороб та ін.

  • Цитологічний аналіз передбачає вивчення числа і

  • морфології хромосом сомаклонів, що дозволяє одержати

  • найбільш переконливі і предметні докази поліплоїдності

  • або міксоплоїдності рослин-регенерантів. Для цитогенетичних

  • досліджень використовують тиснуті препарати з молодих

  • корінчиків рослин або пророслого насіння довжиною 1-2 см.



Методи білкових маркерів базуються на генетичній

  • Методи білкових маркерів базуються на генетичній

  • обумовленості синтезу білків (ферментів), що дозволяє

  • використовувати їх як специфічні індикатори генотипу.

  • Електрофоретичні варіанти білків та ізоферменти – це

  • маркери, за якими тестують належність рослин до виду,

  • біотипу, сорту; встановлюють ступінь спорідненості рослин;

  • виявляють генетичну гетерогенність морфологічно

  • однорідних популяцій.

  • Аналіз ДНК шляхом рестрикції і гібридизації широко

  • використовують для виявлення і вивчення організації

  • послідовностей ДНК після їх електрофоретичного

  • розділення. Аналіз специфічних нуклеотидних послідовностей,

  • їх консервативних повторів, які гомологічні певному ДНК-

  • зонду, допомагає «ловити» генетичні перебудови у

  • сомаклонів.



Протопласти (від грецьк. protos – перший, plastos –

  • Протопласти (від грецьк. protos – перший, plastos –

  • утворений, виліплений) – клітини, які позбавлені своєї

  • клітинної оболонки. Їх можна характеризувати як

  • відокремлені мембраною ядро і цитоплазматичні утворення

  • з власною структурною цілісністю і здатністю здійснювати

  • активний метаболізм, біосинтез і трансформацію енергії.



Методи виділення протопластів:

  • Методи виділення протопластів:

  • 1. Механічний

  • Протопласт у гіпертонічному розчині віддає воду,

  • зменшується в об’ємі і відокремлюється від клітинних стінок

  • (згортається у клубок). Такого роду методи ізоляції

  • протопластів називають механічними

  • Недоліки:

  • Виділяється невелика кількість протопластів;

  • Використовуються тільки ті тканини, в яких відбувається екстенсивний плазмоліз;

  • Важко одержати протопласти з меристемних тканин;

  • Протопласти зазнають сильного осмотичного шоку;

  • Метод довготривалий і трудомісткий.



2. Ензиматичний

  • 2. Ензиматичний

  • Ензиматичний спосіб був запропонований англійським

  • вченим Е.Кокінгом, який у 1969 році за допомогою

  • спеціальних ферментів руйнував целюлозно-пектинову

  • оболонку і одержував «голі» клітини – протопласти. Після

  • вдалих робіт І. Такебе (1971) ензиматичний метод знайшов

  • широке застосування при виділенні протопластів у

  • багатьох лабораторіях світу

  • Переваги ензиматичного методу:

  • Одночасно можна виділяти і працювати з великою кількістю протопластів (106 – 109);

  • Протопласти не зазнають сильного осматичного ущільнення, вони більш інтактні і непошкоджені;

  • Метод відносно швидкий.



  • Соматична гібридизація (синонім – парасексуальна

  • гібридизація) – гібридизація соматичних клітин шляхом

  • злиття їх ізольованих протопластів (англ. Fusion of

  • protoplasts).

  • 1. Хімічний метод передбачає обробку протопластів

  • поліетеленгліколем (ПЕГ), а потім – буферним розчином з

  • високим вмістом Са2+, рН 10,5. Додавання ПЕГ до

  • батьківських протопластів приводить до їх злипання в

  • результаті дегідратації.

  • Поглинання вільної води призводить до утворення

  • Отворів по всій поверхні плазмалеми і відбувається

  • перетікання внутрішньоклітинного матеріалу.



  • 2. Метод електрозлиття протопластів (Ватс Д, Кинг Дж.,

  • 1984; Хан-Хагердал В., Борнман Х., 1986). Протопласти

  • суспензують між двома електродами. При дії змінного

  • струму проходить діелектрофорез і протопласти шикуються

  • у ряд таким чином, що приєднуються своїми полярними

  • поверхнями один до одного. Потім накладають сильний

  • імпульс постійного струму (600в/см 10-20 мкс), який

  • обумовлює утворення отворів ущільнених мембранах.

  • У місцях контактів протопластів утворюються містки, по

  • яких відбувається перетікання цитоплазм у вигляді

  • міжпротопластного обміну.

  • При злитті протопласта і цитопласта (протопласт без ядра)

  • утворюється соматичний цибрид.

  • Таким чином, генетична основа соматичного цибрида може

  • складатися з елементів двох цитоплазмонів і одного із ядер

  • батьківських протопластів



Для підтвердження гібридної природи отриманих у

  • Для підтвердження гібридної природи отриманих у

  • результаті злиття клітинних агрегатів рослин-регенерантів

  • необхідне проведення цитологічного, біохімічного і

  • молекулярногенетичного аналізів:

  • Цитологічний аналіз.

  • Цей метод достовірний, особливо для міжтрибних,

  • міжродинних гібридів, для батьків яких властива докорінна

  • морфологічна відмінність хромосом..

  • Біохімічний аналіз.

  • Застосовують для аналізу міжвидових гібридів. Вивчають їх

  • за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з

  • наступним фарбуванням білків із визначеною ферментативною

  • активністю – це є найпростішим і найефективнішим засобом

  • біохімічного аналізу парасексуальних гібридів.

  • Молекулярно-генетичний аналіз.

  • Використання рестрикційного аналізу ДНК для дослідження

  • хлоропластів і мітохондрій соматичних гібридів має переваги –

  • можливість виявлення перебудови ДНК, цілого геному. На

  • відміну від ДНК пластид аналіз ДНК мітохондрій за соматичної

  • гібридизації показує, що у вищих рослин можлива рекомбінація

  • між геномами мітохондрій.



  • Клітинна селекціясукупність методів відбору клітинних

  • ліній з новими успадкованими знаками в умовах ін вітро.

  • Основні етапи одержання мутантних форм шляхом

  • селекції на клітинному рівні:

  • Відбір об’єкту для мутагенезу – калусні, суспензійні

  • культури, ізольовані протопласти;

  • Обробка об’єкту мутагеном (фізичні фактори –

  • температура, опромінювання, хімічні речовини та ін.;



  • Інкубація клітин на рідкому поживному середовищі у неселективних умовах;

  • Перенесення суспензії у селективні умови (засолення, токсини, гербіциди, понижені або високі температури, метали та ін.);

  • Виділення життєздатних колоній, які вижили в жорстких селективних умовах;

  • Відбір змінених, стійких до селективного фактора клонів;

  • Індукція органогенезу або ембріоїдогенезу;

  • Одержання змінених рослин-регенерантів, які відрізняються в порівняні з материнськими рослинами;

  • Висадка рослин у грунт, вивчення генетичної природи стійкості, тестування на стійкість.



Об’єктом для мутагенезу і селекції можуть бути

  • Об’єктом для мутагенезу і селекції можуть бути

  • калусні, суспензійні культури або ізольовані

  • Протопласти

  • Калусна тканина – доступний матеріал, який відносно легко одержують у лабораторних умовах. Використовують свіжовиділену калусну тканину, що не втратила регенераційної здатності. Відбір мутантів за допомогою калусних тканин часто використовують при селекції ліній, (стійких до фітозахворювань) і стресових факторів (Левенко Б.О., 1991).

  • Клітинна суспензія – це поодинокі клітини або клітинні агрегати, які вирощують на рідкому поживному середовищі в умовах постійної аерації. Аерація об’єктів забезпечується такими способами:

  • Культурою клітин, які занурені у рідке поживне

  • середовище на качалках ротаційного або шейкерного типу

  • (накопичувальне культивування);

  • Вирощуванням шматків калусуна містках-підтримках з

  • фільтрувального паперу.



Протопласти - голі клітини, які позбавлена оболонки і

  • Протопласти - голі клітини, які позбавлена оболонки і

  • включає ядро і цитоплазму, в якій знаходяться органели.

  • У великих однорідних популяціях гаплоїдних або диплоїдних

  • протопластів проводять кількісні дослідження мутагенезу

  • соматичних клітин, аналізують експресію індукованих

  • фенотипових змін на клітинному і організменому рівні.

  • Основними вимогами, що ставляться до модельних об’єктів у

  • клітинній селекції є:

  • швидкий ріст у культурі ін вітро,

  • збереження регенераційної здатності,

  • невелика кількість хромосом,

  • наявність високоефективної методики виділення і культивування протопластів, клітин,

  • існування справжніх гаплоїдів,

  • короткий життєвий цикл рослин (Сидоров В.А.,1990).



Раптові зміни спадкового матеріалу називають мутаціями.

  • Раптові зміни спадкового матеріалу називають мутаціями.

  • Клітини або організми, які є носіями змінених генів і

  • відрізняються від вихідного (дикого) типу, називають

  • мутантами. Мутації можуть стосуватись як ядерних генів,

  • так і їх цитоплазматичних структур, що несуть у собі ДНК

  • (мітохондрії, хлоропласти).

  • Розрізняють такі типи мутацій:

  • Генні, або точкові, мутації – спадкові зміни гена, які найчастіше відбуваються в одному з двох алельних локусів пари гомологічних хромосом. Мутантні гени є переважно рецесивними.

  • Хромосомні мутації – одна або декілька хромосом виявляють структурні зміни, що викликано розривами та перебудовами хромосомного матеріалу.

  • Геномні мутації обумовлені змінами числа хромосом в хромосомних наборах (геномах) або ж змінами кількості хромосомних наборів у мутованих клітинах. Геномні мутації, як правило, викликають явище поліплоїдії (кратне збільшення числа хромосом).



Плазмонні мутації виникають внаслідок можливих мутацій позахромосомних спадкових структур клітини, окрім локалізованих у пластидах.

  • Плазмонні мутації виникають внаслідок можливих мутацій позахромосомних спадкових структур клітини, окрім локалізованих у пластидах.

  • Пластидні мутації характеризуються змінами пластид хлорофільних зерен (білоплямистість, строкатолистість



Способи відбору необхідних фенотипових варіантів на

  • Способи відбору необхідних фенотипових варіантів на

  • клітинному рівні можна класифікувати так:

  • Пряма (позитивна) селекція, при якій виживає лише певний мутантний тип клітин;

  • Непряма (негативна) селекція. Ґрунтується на вибірковій загибелі клітин дикого типу та виживанні метаболічно неактивних клітин, які потребують додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;

  • Візуальна селекція та неселективний відбір, коли ідентифікація лінії серед всієї популяції клітин відбувається візуально або за допомогою біохімічних методів;

  • Тотальна селекція, яка передбачає індивідуальне тестування всіх клітинних клонів.



  • Кріобіологія (від грецьк. kryos – холод, мороз, лід) – розділ

  • біології, який вивчає дію на живі системи низьких та

  • наднизьких температур (від 0 ºC до абсолютного нуля).

  • Термін «кріозбереження» (анг. cryopreservation)

  • застосовується для позначення складного багатоетапного

  • процесу, метою якого є обмежено тривале зберігання

  • життєздатних клітин, меристем або органів рослин в стані

  • холодового анабіозу. Єдиним надійним засобом для вирішення

  • цієї проблеми є глибокий холод (нижче - 140ºС), який

  • забезпечує використання рідкого азоту (- 196 ºС) або його

  • парів (- 150ºС)



  • Кріозбереження як система єдиного екстремального

  • процесу (заморожування – зберігання – розморожування)

  • складається з таких етапів:

  • підготовка об’єкту,

  • додавання кріопротектора,

  • заморожування в певному режимі,

  • зберігання в рідкому азоті,

  • розморожування,

  • видалення кріопротекторів (відмивка),

  • рекультивація (для клітин),

  • регенерація цілих рослин.

  • Кріопротектори – це речовини, які зв’язують вільну воду

  • як в міжклітинниках, так і в клітинах; ускладнюють її

  • кристалізацію за рахунок утворення з нею водневих

  • зв’язків; зменшують ущільнення протопластів клітин при

  • заморожуванні. Використовують різноманітні речовини -

  • кріопротектори : диметилсульфоксид (ДМСО),

  • поліетиленгліколь(ПЕГ), поліетиленоксид, етеленгліколь,

  • гліцерин, сахарозу, сорбіт, маніт, лактозу та ін.



Генна інженерія – це система штучного конструювання

  • Генна інженерія – це система штучного конструювання

  • рекомбінантних (гібридних) ДНК і введення їх в живий

  • організм з метою одержання спадкових змін.

  • Тобто, це цілеспрямоване переміщення окремих генів з

  • одного генетичного оточення в інше. У результаті спадкова

  • інформація організму змінюється, йому надаються нові

  • генетичні і, відповідно, біохімічні та фізіологічні

  • властивості, корисні для людини. Одержаний в результаті

  • таких маніпуляцій організм позначається як трансгенний



Історія становлення:

  • Історія становлення:

  • 60-і - початок 70-х років, коли Дж.Беквіс з колегами виділили "чистий" ген - галактозидази Е.соli, а в лабораторії Г.Корани був синтезований хімічним шляхом ген аланінової т-РНК дріжджів. У дослідників з'явилась можливість маніпуляції з генами (введення їх або замша на інші).

  • Народженням генної інженерії як самостійної дисципліни можна вважати грудень 1972 р., коли Поль Берг із співробітниками (США, Стендфорський університет) сповістили про створення першої рекомбінантної молекули ДНК.

  • У 1974 році було накладено добровільний мораторій на деякі види досліджень з генної інженерії, проте у 1975 році на міжнародній Асилморській конференції у США мораторій було відмінено, бо очікувані прибутки від генної інженерії перевищують можливу шкоду



Гени одержують одним із трьох способів:

  • Гени одержують одним із трьох способів:

  • Безпосереднім виділенням з природного матеріалу,

  • Шляхом хімічного синтезу

  • Копіюванням інформаційних РНК для одержання комплементарних

  • ДНК (ензиматичний метод).

  • Ген, тобто певну ділянку ДНК, "впізнають" і "вирізають" з

  • цілої молекули ДНК за допомогою спеціальних рестрикційних

  • ендонуклеаз (рестриктаз) Процес з'єднання в єдину

  • структуру фрагментів, що розрізані рестриктазами,

  • здійснюють інші ферменти – лігази. Також використовують

  • вектори - плазміди або віруси (бактеріофаги), які здатні

  • переносити в клітину вмонтований в їх ДНК чужий ген,

  • забезпечуючи там його реплікацію та синтез білкових

  • продуктів. Вектор - це молекулярний прилад для доставки

  • чужорідних генів у різні організми; фактично - це "віз"

  • для генів.



Більшість експериментів з генетичної інженерії

  • Більшість експериментів з генетичної інженерії

  • проводяться на ДНК плазмід бактерій.

  • Плазміди - це невеликі кільцеві молекули ДНК, які

  • присутні у більшості бактерій разом із хромосомною ДНК.

  • Вони здатні до автономної реплікації, тобто несуть гени,

  • що відтворюють власну ДНК



Масштаб досягнень в генній інженерії рослин на

  • Масштаб досягнень в генній інженерії рослин на

  • сьогодні:

  • Для поліпшення смакових властивостей рослинної продукції (надання солодшого смаку) використовують гени синтезу монеліну або тауматину – білків, які в 100000 разів солодші, ніж цукор. Ген синтезу монеліну введено в рослини томатів і цибулі-латуку. Трансгенні рослини накопичують цей білок у значній кількості в плодах і листках.

  • Отримані трансгенні рослини сої і кукурудзи з поліпшеними якостями жирів, з дуже низьким вмістом поліненасичених жирних кислот

  • Клоновано гени запасних білків сої, гороху, квасолі, кукурудзи, картоплі та багато ін.

  • Створенню трансгенні рослини конюшини, що містять ген синтезу білка соняшнику з підвищеним вмістом сірковмісних амінокислот.

  • Отримано насіння трансгенних кормових культур, які містять набір ферментів для підвищення засвоєння кормів, антибіотики, вітаміни та ін корисні складові.



Методами генної інженерії змінюють вміст і склад вуглеводів в бульбах картоплі, томатів, цукрових буряків

  • Методами генної інженерії змінюють вміст і склад вуглеводів в бульбах картоплі, томатів, цукрових буряків

  • Істотним недоліком плодів протягом зберігання є їх розм’якшення після дозрівання , яке обумовлюється ферментом полігалактуроназою. Для усунення цього недоліку перспективним виявився генно-інженерний метод з синтезом цього ферменту, який у трансгенних томатів визиває лежкість, тобто можливість тривалішого зберігання без гниття.

  • У трансгенних рослин томатів і петунії значно зріс термін дозрівання плодів, а також термін цвітіння і обпадання квіток. Використання цього методу може призвести до суттєвих змін у декоративному садівництві: відкриваються можливості значно довше зберігати зрізані квіти без зміни їхніх властивостей.



  • Отримані трансгенні рослини цвітної капусти, що характеризуються затримкою старіння.

  • Серед генів, що визначають стійкість проти гербіцидів, клоновані гени стійкості таких гербіцидів, як Раундап (гліфосат), Баста та ін. Із використанням цих генів отримано трансгенні рослини кукурудзи, сої, бавовнику, картоплі, цукрових буряків, гречки, тютюну та ін.

  • Вивчена можливість отримання трансгенних рослин картоплі, рису, сої, квасолі, пшениці, ячменю, які стійкі проти шкідників за рахунок введення генів рослин з інсектицидною активністю

  • Зі зміненою пігментацією квіток отримані рослини гербери, хризантеми, троянди, гвоздики та ін. Аналогічні підходи використовують для створення квіток зі зміненим забарвленням, а також для зміни пігментації плодів і деревини.




База даних захищена авторським правом ©pres.in.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка